TUNEL檢測是一種用于檢測細胞凋亡（程序性細胞死亡）的方法。細胞凋亡是一種重要的細胞生物學過程，它在多種生理和病理情況下發(fā)揮作用，包括發(fā)育、組織修復和免疫應答等。那么你知道Tunel檢測的實驗步驟與注意事項嗎？讓我們一起來看看吧！

一、Tunel檢測的操作步驟

1. 脫蠟和組織復性

將組織在二甲苯中浸泡兩次，每次10-20分鐘。在100%乙醇中洗滌兩次，每次5分鐘。然后依次在95%，70%和50%乙醇中洗滌3分鐘。

2. PBS洗滌和蛋白酶處理

用200-500 µL PBS洗滌樣品兩次，每次5分鐘。排除組織中多余的PBS，并在20 µg/mL蛋白酶K溶液中孵育15分鐘。

3. TdT標記反應緩沖液/反應混合物孵育

配制TdT標記反應緩沖液。向每個樣品中加入50 µL反應混合物，并在濕盒中避光下37℃孵育2小時。

4. PBS洗滌和DAPI復染

在PBS中將樣品洗滌3次，每次5分鐘。通過在1×DAPI中孵育10分鐘對樣品進行復染。

5. 觀察和拍照

將樣品在PBS中洗滌3次，每次5分鐘。然后加入水性封固劑或防淬滅溶液，封住蓋玻片。最后使用熒光顯微鏡觀察，并進行熒光顯微鏡拍照觀察，紅色通道（Ex/Em=555 nm/565 nm）。

二、注意事項

1. 設立陽性和陰性細胞對照：

陽性組：用DNase酶處理，誘導細胞凋亡，使3'-OH末端暴露。每次實驗只需做一個陽性組。

陰性組：不加TdT酶，其余操作和實驗組相同。

實驗組：除了陽性組和陰性組，所有樣本均屬于實驗組。

2. 選擇固定液：

建議使用4%多聚甲醛（PBS）進行固定。不建議使用乙醇和甲醇作為固定液。不要選用含有甲醇的甲醛替代品，因為這會降低標記效率，使熒光觀察困難。

3. 貼壁細胞處理：

貼壁細胞在加藥誘導凋亡后，細胞狀態(tài)會發(fā)生改變，形態(tài)會皺縮邊緣，貼壁粘附力降低。在對這些細胞進行實驗染色時，需要小心操作，避免吹打造成細胞脫落。特別是在多次洗滌細胞時，操作要小心輕柔。

4. 避光操作和孵育：

熒光基團長期暴露在普通光照下，會發(fā)生嚴重淬滅。

在實驗操作中應盡量避光操作和孵育，以保證熒光觀察效果。

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